一步生長曲線
通過一步生長實驗確定所選噬菌體的裂解量(平均每個感染細胞釋放的噬菌體數量)和潛伏期(從感染到子代噬菌體開始釋放的時間),該方法參考了的描述并略有修改。
圖2噬菌體FSboM-AG3的一步生長曲線。以博氏志賀氏菌C865為宿主,培養溫度為30℃。
透射電子顯微鏡
用于電子顯微鏡觀察的噬菌體樣品制備如下:使用 Beckman J2-21(Palo Alto, Ca)離心機和 JA-18.1 固定角轉子,將噬菌體在 0.1 M 中性乙酸銨溶液中以 25,000 g 離心 60 分鐘進行沉淀。隨后,在相同條件下用 0.1 M 中性乙酸銨溶液洗滌兩次。純化的噬菌體樣品沉積在銅網上的碳涂層 Formvar 薄膜上,用 2% 磷鎢酸鉀(pH 7.0)進行負染,并在操作電壓為 60 kV 的 Philips EM 300 電子顯微鏡下進行觀察。使用 T4 噬菌體的尾部作為標尺來監控放大倍數。
DNA 分離和測序
粗噬菌體裂解液通過 4°C 下 14,000 x g 離心 20 分鐘去除細菌碎片。上清液中的污染核酸使用胰 DNase I 和 RNase A(終濃度均為 10μg/mL,Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON)進行消化,然后加入 10% (w/v, 終濃度) PEG-8000 和 1 M NaCl,于 4°C 沉淀噬菌體顆粒過夜。沉淀的噬菌體顆粒通過離心回收,重懸于 TM 緩沖液(10 mM Tris-HCl, pH 7.8, 1 mM MgSO4)中,并通過在自生氯化銫(CsCl)梯度(CsCl 密度 1.5 g/ml,使用 Beckman SW 90Ti 固定角轉子,4°C 下 21,000 x g 離心 24 小時)上進行分離來純化。經過第二次 CsCl 梯度離心(再離心 24 小時)純化后,使用分子量截留值為 3500 的 Pierce 透析盒(Thermo Scientific, Fisher Scientific, Mississauga, ON),將噬菌體對 1x 10 mM TE 緩沖液(pH 8.0)透析兩次(每次兩升),并于 4°C 儲存。從部分純化的病毒顆粒中提取 DNA,采用基于的 SDS/蛋白酶 K 方法進行修改,隨后用苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1, V/V)抽提,乙醇沉淀,并溶解于 10 mM Tris-HCl(pH 7.5)中。通過分光光度法對 DNA 進行表征。
該 DNA 在麥吉爾大學和基因組魁北克創新中心(蒙特利爾,QC,加拿大)進行了覆蓋度為 19x 的焦磷酸測序(454 技術)。
基因組注釋
在注釋之前,將基因組在 rIIA 基因的上游立即打開,以便與相關的 ViI 噬菌體序列進行比較。基因組首先使用 AutoFACT進行自動注釋,隨后使用 Kodon version 2.0 (Applied Maths Inc., Austin, TX, USA) 確認所有開放閱讀框(ORFs)。從預測的編碼序列中鑒定基因的依據是:存在 ATG、GTG、CTG 或 TTG 起始密碼子,后跟至少 30 個額外密碼子,以及上游序列與核糖體結合位點 GGAGGT 相似。使用默認參數,通過 tRNAScan-SE 和 Aragorn 鑒定噬菌體編碼的 tRNA 基因。
在 http://pfam.sanger.ac.uk/search#searchBatchBlock 進行了批量 PFAM 基序搜索,而使用 http://greengene.uml.edu/programs/FindMW.html 確定蛋白質分子量和等電點。
使用 BLASTP 算法確定與美國國家生物技術信息中心[NCBI]數據庫中已描述蛋白質的相似性,搜索使用 Batch BLAST (http://greengene.uml.edu/programs/NCBI_Blast.html) 進行。使用 DNAMAN 確定噬菌體 SboM-AG3 及其宿主鮑氏志賀氏菌的密碼子使用信息。啟動子的鑒定基于與共識大腸桿菌啟動子 TTGACA(N15-18)TATAAT 的序列相似性,該序列位于注釋基因的上游。通過使用 MFOLD檢查與 polyT 序列相鄰的 DNA 二級結構來發現 ρ-非依賴性終止子。此外,我們還使用了 http://pallab.serc.iisc.ernet.in/gester/rungester.html 的 WebGeSTer。僅報告 ΔG 小于 -10 kcal/mol 的終止子。使用 CoreGenes在蛋白質組水平進行基因組比較。使用 TMHMM v2.0 和 Phobius預測跨膜結構域。
蛋白質組分析
使用 Laemmli 樣品緩沖液(4% SDS, 20% 甘油, 10% 2-巰基乙醇, 0.004% 溴酚藍, 0.125 M Tris HCl)裂解完整的噬菌體顆粒,并煮沸 5 分鐘。隨后,溶解的蛋白質通過 12.5% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離,并使用 SimplyBlue SafeStain(Invitrogen Canada, Burlington, ON)染色。使用 BioNumerics 軟件(Applied Maths)分析凝膠數據。六個最強烈的噬菌體條帶被切下,并在女王大學(安大略省金斯頓,加拿大)的質譜設施中進行質譜分析。
基因組序列
志賀氏菌噬菌體 SboM-AG3 的注釋基因組序列已存入 NCBI 核苷酸數據庫,登錄號為 FJ373894。
